Американский и европейский гнильцы

Окт, 2012
28

К диагностике американского и европейского гнильцов

Опубликовал: Petr_MS

Клинические признаки, наблюдаемые при заболевании расплода американским и европейским гнильцами: пестрый расплод, изменение цвета личинки, ее разложение с последующим образованием сухой корочки — имеют место с небольшими вариациями и при гибели личинок, вызванной грибами (аспергиллез) и вирусами (мешотчатый расплод), а также при застуженном расплоде, что затрудняет постановку диагноза. Обсуждаемая в последнее время якобы беспричинная гибель пчелиных семей и слеты (коллапс) могут иметь весьма конкретную причину. К сожалению, квалифицированного лабораторного исследования по выяснению причин гибели расплода в последние годы в большинстве регионов РФ не проводится.

Возбудитель американского гнильца — спорообразующая бактерия Penibacillus larvae. В вегетативной форме она представляет нитевидные палочки со жгутиками длиной 2,5-5 мкм. Споры — крупные, 1,0-1,9 мкм. В процессе спорообразования жгутики группируются в косички, которые видны под микроскопом. В одной погибшей личинке за короткое время накапливается более миллиарда спор, которые устойчивы к высокой температуре и химическим средствам. Во внешней среде (пустых ульях) споры сохраняются десятки лет. Заражение личинок происходит только спорами.

Болезнь характеризуется массовой гибелью запечатанного расплода, достигающей 30%. Ячейки сота заполнены тянущейся слизистой массой коричневого цвета с запахом столярного клея. При высыхании, которое наступает примерно через 30 дней, образуются темно-коричневые или черные корочки, трудно извлекаемые из ячейки. Крышечки ячеек западают и продырявливаются. В соте встречаются пустые ячейки, что придает ему пестрый вид. Если личинка гибнет в стадии куколки, то характерным признаком болезни является наличие «язычка», выступающего из головки. Продуктивность пчелиных семей снижается до 40-70%. В Центральном регионе России болезнь клинически проявляется в июне-июле, в южных — в мае-июне.

Первые случаи заболевания пчел на пасеке должны быть подтверждены заключением официальной ветеринарной лаборатории и зарегистрированы. Болезнь представляет большую опасность для пчеловодства, и ее относят к карантинным. Заболевание распространено во всем мире.

В лабораторию направляют образец сота размером 10×15 см, содержащий максимальное количество погибшего расплода, упакованный в картонный или деревянный ящик. В лаборатории исследуют под микроскопом мазки, приготовленные из первичного материала и окрашенные различными методами; изолируют возбудителя на питательной среде и определяют его культурально-биохимические свойства.

Мазки готовят из водной суспензии ткани личинок и окрашивают по Граму с целью определения морфологии вегетативной формы возбудителя, которые окрашиваются грамположительно. Споры окрашивают 2%-ным спиртовым раствором карболового фуксина. Споры P. larvae обладают броуновским движением, которое можно обнаружить по методу модифицированной висячей капли. С этой целью мазок окрашивают карболовым фуксином в течение 30 с, споласкивают водой, и пока он еще влажный, покрывают тонким слоем иммерсионного масла. Избыток жидкости удаляют и просматривают под микроскопом. В поле зрения микроскопа в каплях воды, заключенных в масло, наблюдают движение спор. Этот признак считается специфическим для спор американского гнильца.

Если инфекция развивается в личинке менее 10 дней, в мазках обнаруживают длинные вегетативные формы бактерии, споры.

Для культивирования возбудителя чаще всего используют среду Бейли, которая может быть твердой (2% агара) или полужидкой (0,3%). Рекомендуется также мясопептонный сывороточный агар (10% лошадиной сыворотки). Суспензию, приготовленную из ткани личинок, прогревают при 80°С в течение 10-15 мин для инактивирования вегетативных форм бактерий и высевают на питательную среду в чашках Петри, используя стерильный ватный тампон или пастеровскую пипетку. Посевы инкубируют в течение 2-4 суток при 34°С. Возбудитель растет в виде отдельных небольших непрозрачных колоний или сплошного налета. P. larvae не образует каталазу, не обладает гемолитической активностью, восстанавливает нитриты, свертывает молоко, расщепляет глюкозу с образованием кислоты.

В меде споры находятся в незначительном количестве и поэтому их предварительно концентрируют, используя диализные трубки.

Возбудитель европейского гнильца Mellissococcus plutonius — неспорообразующая неподвижная бактерия, имеющая форму клиновидного кокка, в мазках располагается одиночно, цепочкой или в виде розеток. Величина кокка — 0,5-1,0 мкм, образует капсулу, которая окружает несколько бактерий. Нативные мазки готовят из водной суспензии ткани личинки или, что лучше, из содержимого средней кишки.

Наиболее распространенный метод окраски мазков — негативный (5%-ный водный раствор нигрозина), при котором хорошо выявляется ланцетовидная форма бактерии. Возможна окраска мазков по Граму и карболовым фуксином. Для культивирования применяется среда Бейли — плотная или полужидкая. Лучший материал для изоляции возбудителя — свежепогибшие личинки. Водную суспензию ткани личинки (1:10) или содержимое средней кишки высевают на питательную среду. Первичные посевы культивируют в атмосфере, содержащей 10% углекислого газа, при температуре 34°С. На плотном агаре возбудитель растет в виде небольших (1,0-1,5 мм) белых или матовых колоний в течение 4-5 суток. Сохраняют культуру на косом агаре, в пробирках под резиновыми пробками в течение нескольких месяцев или в лиофилизированном состоянии.

Кроме М. plutonius из патологического материала может быть выделена вторичная микрофлора — Enterococcus faecalis, а также Paenibacillus alvei. Европейский гнилец — болезнь 3-4-дневных личинок открытого расплода, редко в запущенных случаях поражается печатный расплод. Относится к карантинным болезням. Она чаще возникает и проявляется в мае—июне в Центральном регионе России. В пораженных семьях пчел расплод пестрый, в различных местах сота беспорядочно расположены открытые ячейки с яйцами, разновозрастными личинками, печатный расплод с продырявленными крышечками и пустые ячейки после удаления из них пчелами погибших личинок. Заболевшие личинки вытягиваются вдоль стенки, поднимаются к отверстию или погибают на дне с загибающимися вверх или вниз концами тела, иногда свертываются в штопор. Тело личинки становится тусклым, желтоватым или серо-белым, отечным, дряблым, сегментация сглаживается. Кожица личинки прозрачная, сквозь нее видны белый (в норме желтый) кишечник и трахеи. В последующем погибшая личинка оседает на дно ячейки, становится влажной, плоской, легко рвется при извлечении, превращается в тестообразную желто-коричневую массу, вытягивающуюся в толстые, короткие, легко рвущиеся нити или представляет водянистую желтоватую жидкость, вытекающую при наклоне сота. Высохшие личинки в виде темных легкоудаляемых корочек располагаются на дне ячеек. Пораженные личинки могут погибать в первые 1-2 дня после запечатывания расплода. Крышечки над таким расплодом темнеют, западают, иногда продырявливаются. В ячейках содержится темно-коричневая гнилостная масса с неприятным запахом. Семья пчел постепенно слабеет и погибает.

Европейский гнилец, вызываемый М. plutonius, следует отличать от других болезней со сходными клиническими признаками. Аналогичные изменения в открытом расплоде можно видеть при поражении его Вас. laterosporus, при парагнильце и других формах атипичного гнильца бактериального происхождения. На первой стадии заболевания личинок изменения их положения в ячейке, формы и цвета подобны при застуженном расплоде, мешотчатом расплоде, американском гнильце, аскосферозе, аспергиллезе. При всех поражениях стадии развития пчелы заразного и незаразного происхождения наблюдают пестрый расплод на соте, взрослые пчелы распознают и удаляют заболевших и погибших личинок раньше (на 1-2 сут), чем их может заметить пчеловод.

Описанная диагностика, рекомендуемая в настоящее время, трудоемка и предполагает выделение чистой культуры возбудителя. В результате истинная причина гибели расплода во многих случаях остается невыясненной.

В последние годы фирма VITA (Великобритания) предложила серологическую тест-систему Vita-Test, которую можно использовать на пасеке для постановки предварительного диагноза в течение 20-30 мин на американский и европейский гнильцы соответственно. Тест основан на иммунологической реакции возбудителя с антителом, сорбированным на бумаге. Наборы содержат пластмассовую пластинку с индикатором, двумя окнами, пластмассовую палочку, пипетку и буферный раствор. Непосредственно на пасеке или в лаборатории взятую из сота заболевшую личинку помещают во флакон с бусами, энергично встряхивают в течение 20 с и с помощью пипетки выдавливают в окно 3 капли суспензии. При наличии возбудителя в личинке в смотровом окне появляется синяя полоса через 1-3 мин в сравнении с рядом расположенной контрольной полосой.

Фирма любезно предоставила нам такие наборы, за что выражаем глубокую благодарность. Эти наборы мы использовали на суспензиях здоровых личинок и недавно зараженных европейским и американским гнильцами, аскосферозом. Материал поступил в лабораторию из различных регионов РФ. Наличие возбудителя М. plutonius подтверждено традиционным методом микроскопией мазков и культурально. Использовали параллельно два набора. Во всех случаях на наборе ЕРВ Тез1 получены положительные результаты с недавно зараженными личинками, из которых выделен М. plutonius. Отрицательный результат получен на здоровых личинках, а также на личинках, пораженных аскосферозом, и при испытании набора для выявления американского гнильца. Опыты показали высокую специфичность результатов набора EFA- и AFB-test.

Набор рекомендуется для использования специалистами при проверке пасек. Простота работы с ними и сравнительно невысокая стоимость позволяют пчеловодам применить их непосредственно на пасеке. Предварительная проверка патологического материала, высылаемого в лабораторию, позволяют в сопроводительной записке точно указать предмет исследования, сократить время поиска различных патогенов и соответственно уменьшить затраты на диагноз.

Испытание наборов в Великобритании показало их специфичность на уровне 98,6% (К.Wait et al., 2003). Высокая оценка их специфичности дана и в других странах (G.Chioveanu, M.Predoiu, 2007).

В настоящее время использование наборов рекомендовано Международным эпизоотическим бюро для диагностики американского и европейского гнильцов.