21
Опыт молекулярно-генетической сертификации пасеки
Опубликовал: Petr_MSПри современном уровне межпородной гибридизации традиционные методы определения породности пчел недостаточно эффективны. Это уже было нами показано на основе анализа митохондриальной ДНК (мтДНК). После восстановления в 1997—1998 гг. генофонда пасеки «Капова пещера» (заповедник «Шульган-Таш»), пострадавшей в 1980-е годы от завоза серой горной кавказской пчелы, до статуса первой племенной пасеки башкирской популяции среднерусской породы медоносных пчел (будущей башкирской породы) выявлено, что 2 пчелиные матки из 57 отобранных имели южное происхождение [3]. В 1999 г. на пасеке совхоза «Михайловский» Дуванского района Республики Башкортостан, получавшей дотацию Минсельхоза РБ по статусу племенной, 64% пчелиных семей морфометрически соответствовали среднерусской породе. Однако анализ мтДНК у 50 семей показал южное происхождение всех без исключения маток [2].
В ближайшее время широкое внедрение в практику племенного пчеловодства молекулярно-генетической диагностики породности неизбежно, методическое отставание от других отраслей сельского хозяйства и так слишком велико. Однако если метод идентификации пород по мтДНК был разработан еще в 1993 г. французскими исследователями под руководством Джин-Мари Корнуэ [5], то методы породной идентификации по ядерной ДНК, необходимые для полноценного анализа, появились лишь в последнее время. Наиболее результативным по аналогии с генетикой человека оказалось использование микросателлитных локусов. В 2009 г. в Швейцарии были показаны возможности этих маркеров (девять локусов А007, А28, А43, Ас306, АрЗЗ, Ар273, Ар226, Ар289, В24) для идентификации семей темной лесной пчелы и карники, а также для определения долей разных пород при формировании гибридов [6]. Аналогичная работа проделана и коллегами из НИИП (семь локусов А024, А088, НВ-ТНЕ-03, НВ-С16-01, НВ-С16-05, АР043, А113) [1].
Наши исследования полиморфизма микросателлитных локусов, проводившиеся с 2006 г., также позволили разработать и внедрить систему диагностики породности медоносной пчелы. Цель представленной работы, выполненной при финансовой поддержке ООО «Кубанский центр медовых технологий», заключалась в молекулярно-генетической сертификации (оценке породности 90 пчелиных семей) племенной пасеки В.О.Кугейко (село Улу-Теляк Иглинского района РБ), а также в отборе лучших семей для дальнейшей племенной работы и получения высококачественных чистопородных среднерусских маток и пакетов.
По пять пчел из каждой семьи были помещены в спирт и доставлены в лабораторию (16.10.2012). Выделение ДНК проводили из торакса рабочих особей пчел с использованием фенол-хлороформ-гуанидинтиоцианатного метода [4]. Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклере «Терцик» при температурном режиме, включающем 30 циклов. Она состоит из денатурации 94°С (30 с), отжига 55°С (30 с), элонгации 72°С (60 с). Фотодетекцию аллелей ядерных микросателлитных локусов Ар243, 4а110, А024, А008, А043, А113, А088, Ар049, А028 и локуса COI-СОИ мтДНК проводили на спектрофотометре «Vilber Lourmat» путем электрофоретического разделениия продуктов ПЦР в 8% ПААГ и последующего окрашивания бромистым этидием.
В основу диагностики положен анализ генетической структуры популяций, для чего были получены соответствующие матрицы.
Так, матрицы, полученные для географически удаленных чистопородных популяций, показали высокое сходство: колебания частот наблюдаются в пределах 5-10%, отсутствует фиксация аллелей. Для среднерусской породы наблюдалась почти полная идентичность генетической структуры у бурзянской (Республика Башкортостан), красновишерской, одинцовской (Пермский край), чебоксарской (Республика Чувашия) и завьяловской (Республика Удмуртия) популяций и даже у бернской популяции темной лесной пчелы (кантон Берн, Швейцария).
В то же время матрицы популяций среднерусской породы четко отличаются по своей структуре от аналогичных матриц популяций южных пород. Есть различия, хотя и не столь выраженные, между матрицами карпатской и серой горной кавказской пород. Сравнение генотипа отдельной рабочей пчелы или трутня (точнее нескольких) позволяет идентифицировать породу или рассчитать долю примесей в случае гибридной семьи.
По итогам сертификации 19 семей были отнесены к элитному классу, 28 — показали высокое качество генофонда, еще 22 попали в пределы нормы. Все эти 69 семей соответствовали разработанному нами молекулярно-генетическому стандарту «среднерусская порода». Для оставшихся семей с разной степенью гибридизации была рекомендована замена матки. Следует обратить внимание, что все пчелиные матки, ранее отобранные пчеловодом, имели среднерусское происхождение по материнской линии (аллель PQQ локуса COI-COII мтДНК).
А.Г.НИКОЛЕНКО, Р.А.ИЛЬЯСОВ,
А.В.ПОСКРЯКОВ, В.О.КУГЕЙКО
Институт биохимии и генетики Уфимского НЦ РАН,
ООО «Кубанский центр медовых технологий»
E-mail: a-nikolenko@yandex.ru
ж-л «Пчеловодство» №5, 2013 г.Литература
1. Кривцов Н.И., Зиновьева Н.А., Бородачев А.В., Лебедев В.И., Форнара М.С. Дифференциация основных пород пчел с использованием микросателлитов // Вестник Рязанского государственного агротехнологического университета им. П.А.Костычева. — Рязань, 2011.
2. Николенко А.Г., Поскряков А.В. Полиморфизм локуса COI-COII митохондриальной ДНК Apis mellifera L. на Южном Урале // Генетика. — 2002. — Т. 38. — №4.
3. Николенко А.Г., Сатаров Р.Н., Косарев М.Н., Юмагужин Ф.Г. Состояние генофонда пчелы заповедника «Шульган-Таш» // Генетические аспекты сохранения биологического разнообразия. — Уфа, БГУ, 2000.
4. Chomezynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thio-cyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical Biochemistry. — 1987.— V. 162.
5. Garnery L., Solignac M., Celebrano G, Cornuet J.M.A simple test using PCR-amplified mitochondrial DNA to study the genetic structure of Apis mellifera L. // Experientia. — 1993. — V. 49.
6. Soland-Reckeweg G., Heckel G, Neumann P., Fluri P., Excoffier L. Gene flow in admixed populations and implications for the conservation of the Western honeybee, Apis mellifera // Journal of Insect Conservation. — 2009.— V. 13.—N. 3.
Общайтесь со мной:
