О пасеке

Пчеловодство, разведение и содержание пчел. Пчелы и здоровье. Огород, сад, дача.

Апр, 2016
26

Протеолиз

Опубликовал: Petr_MS




Активность протеолитических ферментов у личинок трутней разного возраста

Протеолиз — один из ключевых процессов жизнеобеспечения, поставляющий строительный материал для синтеза белка. Однако концепция протеолиза как инструмента деградации белка в последние годы претерпела существенные изменения: протеолитические ферменты рассматриваются еще и как важнейший регулирующий фактор обмена веществ [1]. Все без исключения структурные белки, ферменты, многочисленные по спектру физиологического действия пептиды в той или иной степени подвержены действию протеолитических ферментов.

Другими словами, акт гидролиза пептидной связи приводит к появлению нового белка (пептида) с другими физико-химическими и биологическими свойствами, что само собой приводит к изменению качественных и количественных характеристик сообщества белковых молекул, надмолекулярных систем во времени и в пространстве, обеспечивая, таким образом, контроль над всем комплексом обменных процессов в живом организме.

В связи со сказанным, а также для понимания роли отдельных протеолитических ферментов в сложной цепи посттрансляционных превращений белковой молекулы большой интерес представляет изучение их в онтогенезе животных, в том числе и насекомых. Превращение белков в ходе онтогенеза насекомых включает в себя три основных процесса: деградацию запасных белков, промежуточный обмен возникающих при этом аминокислот и синтез на их основе новых белков личинок.

Белковый обмен на разных стадиях развития насекомых сопровождается не только полным распадом белковых тел, но и ограниченным протеолизом (Филиппович и др., 1992; Takahashi, Yamamoto, 1993; Ribolla, Debianchi, 1995; Liu et al., 1996), что определяет время жизни и судьбу каждого конкретного белка и задает направление перестройке метаболизма, обеспечивая тем самым контроль не только белкового обмена во времени и в пространстве, но и обмена веществ в целом. Таким образом, превалирующий интерес к протеолитическим ферментам в последнее время обусловлен, прежде всего их ролью в регуляции обмена веществ [1, 5, 6].

В работе исследована активность двух протеолитических ферментов, относительно хорошо изученных по целому ряду параметров у некоторых видов животных: катепсина D и трипсиноподобного фермента [2-4, 6]. О действии их у личинок трутней информация практически отсутствует.

В качестве объекта исследования использовали личинок трутней в возрасте 1-7 суток. Динамика активности исследуемых ферментов в онтогенезе быстрорастущих и активно развивающихся организмов, по нашему мнению, — адекватный показатель для выяснения их роли в процессе метаморфоза.

Большинство исследователей относят катепсин D к ферментам лизосомальной локализации, принимающим участие в реакциях неспецифического протеолиза. Трипсиноподобный фермент характеризуется чаще всего цитозольной локализацией. Считается, что он связан с ограниченным протеолизом, который характерен для посттрансляционной фазы превращения белков и пептидов [1, 5].

Из литературных данных известно, что рН-оптимум этих ферментов у насекомых отличается от рН-оптимума аналогичных ферментов у позвоночных животных [7], поэтому предварительно мы провели кинетический (подобрали уровни, оптимальные для действия ферментов, рН концентрации субстратов, продолжительность инкубации) и ингибиторный анализы.


Для исследования активности протеолитических ферментов использовали 10%-ный экстракт трутневых личинок: 1 г личинок гомогенизировали в 10 мл 0,9%-ного раствора NaCI, затем на рефрижераторной центрифуге в течение 30 минут при 10 000 об/мин отделяли оставшиеся неразрушенные клетки и субклеточные структуры, сливали супернатант, и в нем определяли активность ферментов. Все операции по составлению инкубационных смесей проводили на ледяной бане при температуре 5...7°С.

Субстратом для катепсина D служил 8%-ный гемоглобин; для трипсиноподобного фермента — N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилид или БАПНА (0,4 мг/мл).

Для проведения опытов по изучению активности катепсина D в инкубационную среду, содержащую 120 мкл 0,1 М натрий-ацетатного буфера (рН=4,5), добавляли 40 мкл 10%-ного экстракта трутневых личинок, 40 мкл 8%-ного гемоглобина, перемешивали и на 40 минут помещали в водяной термостат при температуре 37°С. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 5%-ного раствора трихлоруксусной (ТХУ) кислоты. Пробы центрифугировали 20 минут при 4000 об/мин и отбирали 100 мкл супернатанта для проведения цветной реакции. Количество продуктов гидролиза гемоглобина определяли методом Лоури [8]. Из полученных величин оптических плотностей опытных проб вычитали величины оптических плотностей соответствующих контрольных проб, которые отличались от опытных тем, что ТХУ кислоту в них вносили перед добавлением субстрата.

При определении активности трипсиноподобного фермента к инкубационной среде, содержащей 300 мкл 0.05М фосфатного буфера (рН=10) и 250 мкл опытного экстракта, прибавляли 0,5 мл БАПНА; после 30 минут инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 350 мкл 1 н. раствора HCI. В контрольные пробы кислоту вливали перед внесением субстрата. Количество образовавшегося а-нитроанилина определяли спектрофотометрически при длине волны 383 нм.

За единицу активности ферментов принимали такое их количество, которое катализирует высвобождение 1 мкмоля продукта реакции (α-нитроанилина для трипсиноподобного фермента и тирозина для катепсина D) за 1 минуту на 1 мг белка. Количество выделившихся веществ определяли по калибровочной кривой.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программы Microsoft Excel 2010. Сравнение средних значений показателей проводили с использованием t-критерия Стьюдента, дисперсионного анализа и критерия U Манна-Уитни.

действия протеолитических ферментов

Для определения рН-оптимума действия протеолитических ферментов измерение их активности вели в диапазоне рН от 3,0 до 11,0. Полученные результаты (рис. 1) показали, что рН-оптимум действия катепсина D равен 4,5 и практически на единицу сдвинут в  щелочную область в отличие от рН-оптимума действия этого фермента в тканях и органах позвоночных животных (Е. Пресс, 1960; Huang, Tappel, 1971). Показатель рН-оптимума действия трипсиноподобного фермента также сдвинут в щелочную область. Подобный феномен установлен для этого фермента ранее у других насекомых [6].

Для определения подклассовой принадлежности протеолитических ферментов использовали ингибиторный анализ с применением специфических ингибиторов для каждого из исследуемых в работе ферментов. Было установлено, что специфические ингибиторы (пепстатин для катепсина D и ингибитор Кунитца для трипсиноподобного фермента) незначительно подавляют активность названных ферментов — не более чем на 7-10%. Подобные данные были получены рядом исследователей у других насекомых [6].

определения активности ферментов

На рисунке 2 представлены результаты определения активности ферментов у трутневых личинок разного возраста.

Из рисунка видно, что активность катепсина D наименьшая и практически одинаковая у личинок одно- и двухсуточного возраста. На третьи сутки она резко увеличивается (в 2 раза) и затем постепенно снижается с четвертого по седьмой день, но достигнув минимума, остается выше исходного уровня.

По всей видимости, резкое увеличение активности катепсина D на третьи сутки связано с началом активизации процесса гидролиза эндогенных запасных белков с целью обеспечения личинки строительным материалом для синтеза новых белков. Активация катепсина D при тех или иных перестройках в организме разных животных отмечена в ряде работ других авторов [6].

Что касается трипсиноподобного фермента, то здесь выявлена более сложная картина изменения его активности в онтогенезе личинок трутней: обнаружена фазность в ходе процесса. Так, наивысшая активность фермента характерна для двухсуточных личинок (первая фаза усиления), где она в 2 раза выше активности фермента односуточных личинок; на третьи и четвертые сутки наблюдается постепенное, но существенное снижение активности до уровня 60% от исходной.

Далее на пятые-шестые сутки отмечаем вновь повышение активности фермента (вторая фаза усиления) и резкое снижение на седьмые сутки, когда активность становится минимальной и составляет 40% активности односуточных личинок. Видно, что динамика измения активности трипсиноподобного фермента у личинок ранней стадии развития частично повторяет картину изменения активности катепсина D и практически с равной амплитудой. Однако максимальный эффект трипсиноподобного фермента отмечается на вторые сутки, а катепсина D — на третьи.

Тем не менее в определенной степени и тот и другой фермент на ранних сроках личиночной стадии могут выполнять одинаковую функцию — освобождать аминокислоты за счет гидролиза эндогенных белков. Существенная активация трипсиноподобного фермента на пятые-шестые сутки, несомненно, связана с его специфическими функциями, например с закладкой органов и систем — процессом, характерным для личинок этого возраста. Хорошо известно, что трипсиноподобные ферменты — одни из ведущих ферментов генеза регуляторных пептидов [1, 5], и рост его активности на вторые и пятые сутки может сопровождаться образованием тех пептидов, которые участвуют в закладке и развитии органов имаго.

В личинках трутней идентифицированы два фермента, обладающие протеолитической активностью со специфичностью действия катепсина D и трипсина. Установлены рН-оптимумы работы этих ферментов, изучены некоторые кинетические параметры и проведен их ингибиторный анализ. Показана динамика изменения активности исследуемых ферментов в зависимости от возраста личинок, что свидетельствует о вовлечении их в процессы онтогенеза.

М.Т.ГЕНГИН, Ж.В.ГРИШИНА
Пензенский государственный университет
ж-л «Пчеловодство» №2, 2016 г.

Литература

1. Генгин М.Т. Особенности структурно-функциональной организации и физико-химические свойства нелизо-сомальных пептидгидролаз мозга животных: дис... д-ра биол. наук. — Пенза, 2002.

2. Иванов В.Г. Белковый комплекс и протеолитические ферменты желточного содержимого грены тутового шелкопряда Bombyx mori L.: дис... канд. биол. наук. — М., 1985.

3. Коновалов Ю.Д. Свойства, локализация, роль и возможные пути регуляции активности протеиназ и амино-трансфераз в раннем онтогенезе рыб // Успехи современной биологии. — 1986. — Т. 101. — № 3.

4. Немова Н.Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. — Петрозаводск: КНЦ РАН, 1996.

5. Хомутов А.Е., Пурсанов К.А., Перепелюк З.В. Регуляторные пептиды: учеб. — метод, пособие. — Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 2014.

6. Ярыгин Д.В. Изучение комплекса протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда: дис. ... канд. биол. наук. — М., 2000.

7. Cho W.L., Tsao S.M., Hays A.R., Walter R., Chen J.S., Shigirevskaya E.S., Raikhel A.S.Mosquito cathepsin B-like protease involved in embryonic degradation of vitellin is produced as a latent extraovarian precursor // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — Iss. 19.

8. Lowry O.H., Rosebrought N.J., Farr A.G., Randall R.J.Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.— 1951. —Vol. 193.—№ 1.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ: Генгин Михаил Трофимович, д-р биол. наук, проф. кафедры «Общая биология и биохимия», e-mail: gengin07@yandex.ru, тел. 8-927-360-21-17; Гришина Жанна Валерьевна, аспирант кафедры «Общая биология и биохимия», e-mail: grinzanetk@ gmail.com, тел. 8-996-800-01-08.





Организация и оборудование любительской пасеки
Ваше имя: *
Ваш e-mail: *

Понравилась статья? Расскажите друзьям:

Общайтесь со мной:

Google Bookmarks Digg Reddit del.icio.us Ma.gnolia Technorati Slashdot Yahoo My Web News2.ru БобрДобр.ru RUmarkz Ваау! Memori.ru rucity.com МоёМесто.ru Mister Wong

Хотите получать новые статьи на почту? Введите свой Email

 

 

«С этой статьей также смотрят:»

Ваш отзыв


    Обо мне

    E-mail: petr9921()yandex.ru

    Skype: Petr_MS

    HitMeter - счетчик посетителей сайта, бесплатная статистика